ZIEHL-NEELSEN STAIN
Aralık 06, 2018
ZIEHL-NEELSEN STAIN (ZN)
ZIEHL-NEELSEN STAIN (AFB)
PURPOSE:
Used in the demonstration of acid-fast bacteria belonging to
the genus 'Mycobacterium', which include the causative agent for
tuberculosis.
PRINCIPLE:
The lipoid capsule of the acid-fast organism takes up carbolfuchsin
and resists decolorization with a dilute acid rinse. The lipoid
capsule of the mycobacteria is of such high molecular weight that it is
waxy at room temperature and successful penetration by the aqueousbased
staining solutions (such as Gram's) is prevented.
CONTROL:
Any tissue containing acid-fast organisms. Use Millipore filtered water in the waterbath and staining procedure.
FIXATIVE:
10% formalin
TECHNIQUE:
Cut paraffin sections at 4-5 microns.
EQUIPMENT:
Rinse all glassware in DI water, coplin jars, microwave
oven.
REAGENTS:
Ziehl-Neelsen Carbol-Fuchsin
Solution:
Basic fuchsin 2.5 gm
Distilled water 250.0 ml
100% alcohol 25.0 ml
Phenol crystals, melted 12.5 ml
Mix well, filter into brown bottle.
Label bottle with date and initials,
solution is stable for 1 year.
CAUTION: Carcinogen, toxin.
1% Acid Alcohol:
Hydrochloric acid 10.0 ml
70% Alcohol 990.0 ml
Mix well, label with date and
initials, stable for 1 year.
CAUTION: Corrosive.
Methylene Blue
Stock Solution:
Methylene blue 0.7 gm
Distilled water 50.0 ml
Mix well, filter into bottle. Label
with date and initials, stable for 1
year.
Methylene Blue
Working Solution:
Methylene Blue Stock 5.0 ml
Distilled water 45.0 ml
Pour into coplin jar, stable for 2
months.
CAUTION: Avoid contact and inhalation.
PROCEDURE:
1. Deparaffinize and hydrate to distilled water.
2. *Carbol-fuchsin solution, microwave 80 power, 45 seconds, allow
slides to stand in hot solution for 5 minutes. Filter solution once a
week.
3. Wash in running tap water.
4. 1% Acid alcohol until light pink and color stops running.
5. Wash in running tap water for 5 minutes..
6. Rinse in distilled water.
7. Working methylene blue for 30 seconds.
8. Rinse in water.
9. Dehydrate, clear, and coverslip.
*Conventional Method: 60°C oven for 1 hour.
RESULTS:
Acid-fast bacilli bright red(pink)
Background blue
SAFETY/PPE: Wear nitrile gloves, goggles and lab coat. Keep hot,
uncapped, solutions in the exhaust hood. Avoid contact and inhalation.
Basic fuchsin: carcinogen.
Phenol: toxic by ingestion, inhalation and skin absorption. Readily absorbed
through skin, causing increased heart rate, convulsions and death. Will
burn eyes and skin, analgesic action may cause loss of pain. Target organ
effects in digestive, nervous and urinary systems.
Hydrochloric acid: strong irritant to skin, eyes and respiratory system.
Target organ effects via inhalation on skin, respiratory, reproductive and
fetal systems.
Methylene blue: produced deleterious effects on fertility in rats.
INSTAGRAM
FACEBOOK
TWITTER
5 Aralık 2018 Çarşamba
Verem
Aralık 05, 2018
ARB Boyama
ARB Boyama
Bazı bakteri türleri hücre duvarlarındaki farklı özelliklerinden dolayı asitlere karşı
daha dirençlidirler. Aside dirençli bakterilerin hücre yapısında diğer bakterilere göre daha
fazla lipit bulunur. Ayrıca hücrenin etrafında balmumumsu bir tabaka vardır. Tüberküloz,
lepra basili, nokardialar ve diğer mikobakteriler bu gruba girer.
Aside dirençli bakteriler diğer boyama yöntemleri ile kolay boyanamazlar.
Boyanmaları için fenollü ve yoğun boya eriyiklerinin uzun süre ya da sıcaklık etkisi ile
uygulanması gerekir. ARB boyama tüberküloz (verem) hastalığının tanısında en hızlı, ucuz
ve pratik bir yöntemdir.
Preparat hazırlama aşaması, personel ve çevreyi korumak için güvenlik kabini içinde
yapılmalıdır. Hazırlanan preparat korunaklı bir yerde kurutulmalı, tespit işleminden sonra da
basilin canlı kalabileceği unutulmamalıdır.
ARB boyamada yaygın olarak kullanılan üç farklı yöntem vardır: İkisi karbol fuksin
esaslı olan “Ziehl-Neelsen” ve “Kinyoun” boyama, üçüncüsü ise “florokrom” boyamadır.
Florokrom boyama daha duyarlı ve daha az zaman alıcı bir yöntem olmakla birlikte, daha
pahalı laboratuvar donanımı (floresan mikroskop ve boyalar) ve tecrübeli personel
gerektirmesi nedeniyle sınırlı olanaklara sahip laboratuvarlar için pek uygun değildir. Ayrıca
Florokrom boyama yöntemi ile pozitifliği saptanan örneklerde de EZN boyama yöntemi ile
teyit edilmesi önerilmektedir.
Ehrlich Ziehl-Neelsen (EZN) ve Kinyoun yöntemlerinde birinci boya olarak karbol
fuksin, zıt boya olarak metilen mavisi kullanılır. Bu nedenle aside dirençli hücreler mavi
zeminde pembe-kırmızı renkte görünürler.
EZN boyama metodu, ARB boyama yöntemlerinden en sık kullanılanıdır. EZN
boyama yönteminde aşağıdaki işlemler sırasıyla uygulanır:
- Bakteri kültürü ile preparat hazırlanır (yayma, kurutma ve tespit).
- Preparatlar boya sehpası üzerine dizilir. Preparatlar arasında belirli bir aralık bırakılmalıdır. Preparatların birbiriyle temas etmesi çapraz kontaminasyona yol açabilir.
- Preparatın üzerine bütün lamı kaplayacak şekilde karbol fuksin boya solüsyonu damlatılır.
- Preparat alttan 5 dakika boyunca ısıtılır (Isıtma işlemi, bunzen beki veya pamuklu tel ile yapılabilir. Bunun için yaklaşık 30 cm uzunluğundaki bir telin ucuna pamuk sarılır ve bastırılarak sıkılaştırılır. Pamuk alkole batırıldıktan sonra yakılır, lamların altlarında gezdirilerek ısıtma işlemi gerçekleştirilir. Isıtma öyle olmalıdır ki boyadan buhar çıkmalı ama kesinlikle kaynamamalıdır. Lamın üstünde buharlaşmadan dolayı boyasız yer görülürse hemen boya ilave edilmelidir.)
- Preparatların soğuması beklenir. Soğuyunca üzerindeki boya akıtılır. Preparatlar sudan geçirilerek geride kalan boya artıkları uzaklaştırılır.
- Preparat asit-alkol karışımı ile dekolorize edilir (Preparatların üzeri asit-alkol ile kaplanır, bir süre bekletildikten sonra asit-alkol akıtılır, preparat sudan geçirilir. Bu işlem boya akmayıncaya kadar ‘en fazla 3 dakika’ sürdürülür. Preparatlar üzerinde kalan fazla su akıtılarak maksimum düzeyde uzaklaştırılır.)
- Tekrar boyama sehpasına koyulan lamların üzeri metilen mavisi ile kaplanır. 1 dakika beklenir.
- Boya dökülür ve distile su ile yıkanır.
- Havada (Kurutma sehpasına dizilerek) kurutulur ve mikroskopta incelenir. Aside dirençli bakteriler pembe-kırmızı renkte, diğer mikroorganizmalar ise mavi renkte görülürler. Preparatlar tamamen kurumadan incelemeye alınmamalıdır. Boyanmış preparatlar, aside dirençli basillerin renginin solmaması için güneş ışığından korunmalıdır.
INSTAGRAM
FACEBOOK
TWITTER
