Malaşait yeşili ile spor boyama aşamaları aşağıda açıklanmıştır.
Bakteri kültürü ile preparat hazırlanır
(yayma, kurutma ve tespit).
Preparat uygun bir kaynar su banyosu düzeneğinin üstüne yerleştirilir.
Preparatın üzeri % 5’lik malaşit yeşili boya çözeltisi ile kaplanır. Bunun üzerine
daha önceden lamdan daha küçük boyutta olacak şekilde kesilerek hazırlanmış
olan bir kurutma kâğıdı yerleştirilir. Kurutma kâğıdı boya çözeltisini çekerek
ıslanır.
Kurutma kâğıdının üzerine malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılarak kâğıdın sürekli
ıslak kalması sağlanır.
Kurutma kâğıdının ıslaklığı azaldıkça malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılarak
preparat bu şekilde 5–6 dakika boyanır.
Süre sonunda kurutma kâğıdı bir pensle alınarak atılır, preparat yıkanır.
Sulu fuksin veya % 0,5’lik safranin ile 20–30 saniye boyanır.
Yıkanır ve havada kurutulur.
Mikroskopta incelenir. Bu boyamada bakteriler pembe-kırmızı, sporlar yeşil
olarak görülür.
Endospore production is a very important characteristic of some bacteria, allowing them to resist adverse environmental conditions such as desiccation, chemical exposure, extreme heat, radiation, etc. The identification of endospores is also very important for the clinical microbiologist who is analyzing a patient's body fluid or tissue-there are not that many spore-forming genera. In fact, there are two major pathogenic spore-forming genera.
Purpose:
The endospore stain is a differential stain which selectively stains bacterial endospores.
How it works:
Bacterial endospores are metabolically inactive, highly resistant structures produced by some bacteria as a defensive strategy against unfavorable environmental conditions. The bacteria can remain in this suspended state until conditions become favorable and they can germinate and return to their vegetative state. The primary stain applied is malachite green, which stains both vegetative cells and endospores. Heat is applied to help the primary stain penetrate the endospore. The cells are then decolorized with water, which removes the malachite green from the vegetative cell but not the endospore. Safranin is then applied to counterstain any cells which have been decolorized. At the end of the staining process, vegetative cells will be pink, and endospores will be dark green.
(Note: Endospore stains are performed on smears that have been heat-fixed.)
Bazı bakteriler, hücre içerisinde dış etkenlere karşı daha dirençli olan ve “endospor”olarak adlandırılan özel formlar oluşturur. Endospor oluşumundan sonra bakterihücresi ölebilir veya çeşitli etkenlerle hücre parçalanarak dağılabilir. Bu durumda endosporlar serbest hale geçer. Bunlara “spor” denir. Sporların soğuk, sıcak, UV (ultraviyole), ozmotik basınç gibi fiziksel etkilere ve kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması, kimyasal ve fiziksel yapılarının farklılığından kaynaklanmaktadır.
Vejetatif hücre normal boyalarla boyanmasına karşın sporun etrafında kalın muhafazaların bulunması ve bunların geçirgen olmaması boyanmalarını zorlaştırır. Bundan dolayı özel spor boyama yöntemleri geliştirilmiştir. Endosporların normal çevre sıcaklıklarında boyaları içlerine almaya karşı dirençleri vardır. Ancak boyama esnasında ısıl işlem uygulanması endosporların bu direncini kırmakta ve endosporların boyayı içlerine alarak boyanmalarını sağlamaktadır. Spor boyaması için başlıca iki metot geliştirilmiştir.