mikroorganizma
Ocak 02, 2019
BESİYERİ HAZIRLAMA
BESİYERİ HAZIRLAMA
Besiyeri Hazırlık Aşamaları
Piyasada farklı amaçlar için kullanılan yüzlerce besiyeri çeşidi vardır. Aynı amaç için
kullanılan farklı besiyeri çeşitleri de mevcuttur bu nedenle besiyerleri çok farklı şekillerde
hazırlanabilir fakat temel basamaklar değişmemekte, basamaktaki yöntem, şekil, süre gibi
unsurlar değişebilmektedir.
Genel olarak besiyeri hazırlamada temel işlem basamakları; besiyeri hazırlama ön
işlemleri (besiyeri seçimi, hacmi ve tartılacak dehidre besin maddesi miktarlarının
hesaplanması gibi), tartım, çözündürme, berraklaştırma, pH ayarlama, sterilizasyon ve
sterilizasyon sonrası işlemler şeklindedir.
Tartım
Tartımın yapılacağı terazinin duyarlılığı, besiyerinin hazırlanış şekli ile doğrudan
ilgilidir. Günlük kullanım için genel olarak 0,1 gram duyarlılığındaki terazi yeterli olacaktır.
Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullanılmalı, doğrudan erlen
ya da balona tartımdan olabildiğince kaçınılmalıdır. Özellikle bileşimden hazırlamalarda
tartım sırasında her madde için temiz spatül (kaşık) kullanılması, besiyeri ve/veya besiyeri
bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra hata yapmamaya özen gösterilerek tartımın elden
geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir.
Çözündürme
Besiyerine ilave edilecek su ayrı bir mezürde bulundurulmalıdır. Prensip olarak
kullanılacak suyun hacmi ile mezurun hacmi birbirine yakın olmalıdır. Suyun yaklaşık 1/3'ü
uygun bir kaba aktarılır ve bunun üzerine tartılmış dehidre besiyeri ilave edilir. Bu uygulama
ile cam kabın tabanına dehidre besiyerinin yapışarak erimemesine bağlı sterilizasyon
hatalarının önüne geçilir.
Suyun geri kalan kısmı, cam kap boğazında ve iç çeperlerde kalabilen besiyeri
parçacıkları yıkanarak kaba ilave edilir. Bazı besiyerleri soğuk suda kendi hâlinde 5-10
dakika bırakılıp elle hafifçe bir çalkalama sonunda tümüyle eriyebilir. Bazı besiyerleriyse
sıvı formda olsalar bile eritilmeleri için mutlaka ısıtılması gerekir.
Agarlı besiyerleri, hazırlandığı kapta otoklavlanacak olsa bile önce agarın erimesini
sağlayacak şekilde ısıtılmalı, iyice karıştırılıp sonra otoklavlanmalıdır. Isıtma işleminde
genellikle benmari, ısıtıcı tabla gibi cihazlardan yararlanılır.
Isıtıcı tabla kullanılıyorsa manyetik karıştırıcılı olanlar tercih edilmelidir aksi hâlde
sürekli elle karıştırılıp erlen dibinde kalabilecek erimemiş parçaların yapışmasına ve
yanmasına engel olunmalıdır. Erlen, açık alevde ısıtılarak besiyeri eritme yoluna
gidilmemelidir.
Berraklaştırma
Ürediklerinde bulanıklık oluşturan mikroorganizmaların tanımlanmalarında kullanılan
ve doğal çökelti maddeleri içeren besiyerleri berraklaştırılır. Besiyeri, adi filtre kâğıdından
veya pamuktan geçirilerek, santrifüjlenerek veya kapta bekletilerek kaba partiküllerin
çöktürülmesi ile berraklaştırılabilir. Besiyerinde çökelmiş veya çözünmemiş parçacıklar
mikroorganizma gelişmesinin değerlendirilmesinde yanıltıcı olabilir.
pH Ayarlama
Besiyeri pH'ı denince sterilizasyon sonrası oda sıcaklığındaki (25 °C) pH değeri
anlaşılır. Yöntemine uygun depolanmış ve raf ömrü bitmemiş ticari dehidre besiyerlerinde
nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması, besiyerinin doğru hazırlanması ve
sterilizasyonun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besiyeri pH'ında bir
sorun çıkmaz.
Besiyerinin pH’ı otoklavlanmadan önce ayarlanacaksa 0,2-0,4 kadar yüksek
ayarlanmalıdır çünkü otoklavdan sonra besiyerinin pH’ı bir miktar düşebilir. Sterilizasyon
sonrasında pH ayarlanması gerekliyse aseptik koşullarda alınacak belirli bir hacimdeki
besiyerinde titrasyon ile pH ayarlaması yapılır, basit orantı ile asıl kaptaki besiyerine ilave
edilecek asit ya da alkali miktarı hesaplanır.
pH ayarlaması için pH metre veya pH indikatör kâğıdı da kullanılabilir. Bunun için
ölçüm ve ayar yapılacak sınırları açıkça gösteren pH kâğıdı kullanılmalıdır. pH kâğıdı ile
yapılan ölçümün çok duyarlı olmadığı, sadece fikir vereceği göz önünde tutulmalıdır.
Potato dextrose agar, BAT agar örneklerinde olduğu gibi besiyerinin çok asitli olması
gerekliyse sterilizasyon sonrasında asit ilave edilir. Örneğin, potato dextrose agar
otoklavlanıp 45 °C'ye soğutulduğunda üzerine filtre ile sterilize edilmiş %10 tartarik asit
çözeltisinden 14 mƖ/Ɩ olacak şekilde ilave edilir, karıştırılır ve petri kutularına dökülür. Bu
işlem ile pH 5,6' dan 3,5' e düşürülmüş olur.
Sterilizasyon
Kullanıma hazır steril besiyerleri ve besiyeri katkıları dışında laboratuvarda hazırlanan
tüm besiyerleri ve besiyeri katkı maddeleri sterilize edilmelidir. Sterilizasyonda amaç;
dehidre besiyeri, besiyeri katkıları ve besiyeri hazırlanırken kullanılan araç gereç ve
ortamdan bulaşabilecek tüm mikroorganizmaları yok etmektir. Böylece besiyerinde yalnızca
örnekten veya ana kültürden gelen mikroorganizmaların gelişmesi sağlanır.
Deney tüpünde besiyeri hazırlanacaksa pH ayarlaması yapıldıktan sonra deney
tüplerine dağıtılarak tüplerin ağızları pamuklanır. Tüplerin pamuklanmasında yağlı pamuk
(kalaycı pamuğu) kullanılmalıdır. Hidrofil pamuk besiyerinin ve havanın nemini çekerek
küflerin üremesi için elverişli bir ortam sağlayacağı için kullanımı uygun değildir ayrıca
absorban pamukların, bakterilerin üremesine engel olan bazı maddeler salgıladıkları da
anlaşılmıştır.
Tüplerin ağzındaki pamuk tıpalar ne fazla sıkı ne de gevşek olmalıdır. Tüp, pamuk
tıpadan tutulduğundan rahatça havaya kaldırılabilmelidir. Pamuğun tüp içinde kalan kısmı
1,5-2 cm kadar, besiyerine olan uzaklığı da en az 1,5 cm olmalı, besiyeri ile temas
etmemelidir.
Besiyerlerinin sterilizasyonunda genel olarak otoklavda basınçlı buhar altında
sterilizasyon yöntemi kullanılır. Bu yöntemle steril edilemeyen bazı besiyerlerindeyse
kaynatma, çok nadiren tindalizasyon ve membran filtrasyon yöntemi uygulanmaktadır.
Işınlama ise pratik olarak uygulanacak bir yöntem değildir, sadece özel amaçlı dehidre
besiyeri üretiminde kullanılır. Besiyerleri ve çözeltiler gibi sıvıların kuru sıcakta sterilize
edilmesi söz konusu değildir.
Petri kaplarında besiyeri hazırlanacaksa besiyerinin erlen veya balon içinde sterilize
edilmesi gerekir. Petri kapları içinde sterilizasyon işlemi yapılmaz. Erlen veya balonun ağzı
da pamuk tıpalarla kapatılır. Büyük pamuk tıpaların tülbente sarılıp üstten bağlanmaları veya
aliminyum folyo ile kaplanmaları gerekir. Böylece pamuk liflerinin aralarındaki
boşluklardan besiyerinin kontamine olması engellenebilir. Burgulu kapaklar ise besiyeri
otoklava girmeden önce yarı açık bırakılmalı, otoklavdan çıkartıldıktan sonra tamamıyla
kapatılmalıdır.
Besiyeri Hazırlarken Dikkat Edilecek Hususlar
Besiyeri hazırlarken aşağıda belirtilen hususlara dikkat etmek gerekir.
- Besiyerleri üretici firma tarafından belirtilen şekilde hazırlanmalıdır.
- Aynı isimdeki besiyerine ait farklı marka ürünlerin hazırlanmasında farklılıkların (sterilizasyon yöntemi, tartılacak miktar gibi) olabileceği unutulmamalıdır.
- Katkı ilave edilecek besiyerleri içine manyet (balık) ilave edilmeli, bu şekilde sterilize edilmelidir.
- Agarlı besiyerleri otoklavlama öncesinde mutlaka kaynar su banyosunda ya da mikrodalga fırında eritilmeli sonra otoklavlanmalıdır ancak besiyeri hazırlanmasında otoklav kullanılmıyor ise bu koşul geçersizdir, ilgili besiyerinin hazırlanması ile ilgili talimata uyulmalıdır.
- Agarlı besiyerlerinin otoklav sonrası tekrar eritilmesi ile besiyeri performansında azalma olacağı unutulmamalıdır. Bu performans kaybı besiyerinin bileşimi ile doğru orantılıdır. Genel olarak plate count agar gibi basit bileşimli besiyerleri daha az zarar görür. Otoklavlanmadan ve sadece ısıtılarak sterilize edilen besiyerleri (Örneğin rambach agar) tekrar eritilmez. Besiyerine katkı ilave edilmiş ise tekrar eritilmez.
- Besiyeri hazırlanmasında distile su kullanılmalıdır.
- Otoklav sonrası katkı ilave edilecek ise sıvı besiyerinin oda sıcaklığına gelmesi beklenir. Agarlı besiyeri ise bir süre oda sıcaklığında tutulup yaklaşık 50 oC' de soğuduğunda 45 oC' deki su banyosuna alınır, bu sıcaklığa düştüğü zaman daha önce oda sıcaklığına getirilen katkı ilave edilir, tercihen manyetik karıştırıcıda katkı ile besiyeri yavaşça karıştırılır ve petri kutularına dökülür. Karıştırma işleminin anafor olacak düzeyde yüksek devirde yapılmamasına özen gösterilmelidir aksi hâlde oluşacak hava kabarcıkları da petri kutusuna geçer ve daha sonra yapılacak çalışmaları zorlaştırır.
- Agarlı besiyerine otoklav sonrası buzdolabında korunmakta olan katkı ilave edilecekse katkının soğuk olması hâlinde yer yer donmalar görülür. Bu nedenle katkı, önceden oda sıcaklığına getirilmelidir.
- Sterilize edilmiş besiyerlerinin kontamine edilmemesine özen gösterilmeli, kuşku duyulursa bu besiyerleri asla kullanılmamalıdır.
- Otoklavlama süresi besiyerinin hacmi, kullanılan cam kapların et kalınlığı, besiyerinin agarlı olup olmamasına göre belirlenmelidir.
- Besiyeri hazırlandıktan sonra bekletilmeden sterilize edilmelidir. Dehidre besiyeri ve/veya besiyeri bileşenleri ile cam kaplar, su, tartım ekipmanı vb. materyalde mikroorganizma bulunması doğaldır. Bunlar hazırlanmış besiyerinde hızla gelişerek besiyerinde başta pH değişmesi olmak üzere bir seri olumsuzluklar meydana getirir. Buna bağlı olarak hazırlanmış besiyerleri en geç 1 saat içinde sterilize edilmelidir.
- Tüm besiyerleri ısıya duyarlı olan pepton ya da ekstraktlar içerir. Bu nedenle aşırı ısı girişinden kaçınılmalıdır. Pepton ve şekerleri içeren besiyeri aşırı ısıl işlem görürse karamelleşme oluşur. Bu şekilde kararmış besiyerleri analizlerde kullanılmamalıdır.
- Kullanılacak besiyerleri ile önceden kullanılmış ve yıkama öncesi sterilize edilecek besiyerleri aynı anda otoklavlanmamalıdır.
